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流式細胞術常見樣本的制備與保存

2022-08-08 瀏覽次數:136

流式細胞術是當代細胞分析技術之一,包括細胞計數、細胞內/外抗原分子檢測、細胞中DNA和RNA的倍體分析、細胞的生物學特性及功能分析等。

對于流式細胞分析而言,樣本制備的好壞對最終的檢測結果有很大的影響。在免疫學和血液學中,應用流式細胞術分析的樣本多為外周血、骨髓、各類體液(如腦脊液、胸水、腹水)以及人體的組織(如淋巴結、脾、肝等),這幾種樣本要如何制備和保存呢?

外周血/骨髓

  1. 保存方法

收集樣本后置于加有抗凝劑(一般選擇肝素或EDTA)的試管中,室溫保存,盡量在12 h內處理樣本;若無法及時處理,4℃保存,此時最好選擇肝素抗凝管。

  1. 處理方法

一般不需要特殊處理制備單細胞懸液,所用試劑為淋巴細胞分離液和紅細胞裂解液。但在臨床檢測中,為了避免細胞成分丟失,通常不推薦使用淋巴細胞分離液分離單核細胞。

  1. 抗凝劑的選擇

血液標本可以使用EDTA、ACD(枸櫞酸葡萄糖)或肝素抗凝。

一般認為,ACD和肝素抗凝的樣本72 h內細胞是穩定的;EDTA抗凝48 h內是穩定的。

EDTA適用于白細胞的免疫表型分析,可防止成熟的髓系細胞貼壁造成細胞損失,并具有較強的抗血小板凝集能力,但對細胞活性的保持不如肝素抗凝。同時EDTA是二價陽離子的強螯合劑,會影響與Ca2+相關的抗原位點(如CD11b等),并會抑制與Ca2+ 相關的細胞功能。肝素常用于白細胞功能研究,可維持Ca2+和Mg2+在細胞內的生理濃度,更好保持細胞活性,適用于放置時間較長、不能及時檢測的樣本,但不適合血小板的相關檢測。

骨髓樣本優先選擇肝素抗凝。

體液

血清.png

  1. 保存方法

收集樣本后置于肝素抗凝管中,室溫保存,且盡量在12 h內處理樣本。若無法及時處理,則4℃保存,時間最好不超過48 h。

  1. 處理方法

  2. 樣本1000-1500 rpm離心5 min,棄去上清;

  3. 加入含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PBS),離心洗滌5 min;

  4. 加入適量PBS重懸。如有細小沉淀,用300目尼龍網過濾后備用。


組織

血清.png


  1. 保存方法

切取新鮮組織樣本置于生理鹽水或PBS中,室溫保存,盡量在12 h內處理樣本;若無法及時處理,4℃保存,保存時間最好不要超過48 h。不建議用甲醛、乙醇固定細胞,不要用酶、表面活性劑處理細胞。

  1. 處理方法

常用的組織樣本制備單細胞懸液方法有:機械法、酶處理法、化學試劑處理法及表面活性劑處理法,在流式分析中,為保持抗原活性,多采用機械法處理樣本。采用機械法需注意動作輕柔,盡量減少細胞的損傷。

若實驗室無單細胞制備儀,手工剪切制備單細胞懸液:

  1. PBS清洗組織樣本,去除大量紅細胞;

  2. 用眼科剪將組織剪成極小塊,再次PBS清洗;

  3. 組織小塊加入勻漿器中,加少量PBS勻漿;

  4. 用細注射針頭抽取細胞懸液;

  5. 300目尼龍網過濾;

  6. 加入含0.1%牛血清白蛋白的PBS;

  7. 1000-1500 rpm離心5 min,棄去上清;

  8. 加入適量PBS重懸。




 




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